Plasmide CRISPR d'Activation (h) N4BP2: sc-412585-ACT

N4BP2 (NEDD4 binding protein 2) est une grande protéine intracellulaire impliquée dans la signalisation dépendante de l’ubiquitine grâce à son interaction rapportée avec les ligases E3 de la famille NEDD4, ce qui la relie à la régulation du renouvellement des protéines et de la transduction du signal. Elle a été associée au contrôle de l’organisation du cytosquelette et de la motilité cellulaire, en accord avec des rôles dans la dynamique de l’adhérence et le trafic intracellulaire. Les profils d’expression de N4BP2 et les altérations génétiques qui l’affectent ont été étudiés dans des contextes cancéreux et immunitaires, ce qui étaye sa pertinence pour des voies modulant la prolifération, les réponses au stress et la signalisation inflammatoire. Ces caractéristiques font de N4BP2 une cible utile pour disséquer les interactions croisées des voies de l’ubiquitine et les programmes transcriptionnels en aval dans des modèles de cellules humaines.

N4BP2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de N4BP2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

N4BP2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus N4BP2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription N4BP2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de N4BP2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus N4BP2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de N4BP2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie N4BP2 dans les cellules tumorales présentant une expression de N4BP2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.