Plasmide CRISPR d'Activation (h) N-SMase2: sc-401937-ACT

Le gène humain **SMPD3** code la sphingomyélinase neutre 2 (N-SMase2), une enzyme membranaire associée et dépendante du Mg2+ qui hydrolyse la sphingomyéline pour produire de la céramide et de la phosphocholine. Par la production de céramide, N-SMase2 contribue à coordonner la signalisation des sphingolipides liée au remodelage des microdomaines membranaires, au trafic vésiculaire et à des voies de réponse au stress qui influencent l’apoptose, la sénescence et la signalisation inflammatoire. L’activité de SMPD3 s’inscrit à l’interface de réseaux de signalisation métaboliques et induits par des cytokines, et participe à la régulation de l’homéostasie des cellules neuronales, osseuses et épithéliales. Un déséquilibre sphingomyéline–céramide impliquant N-SMase2 a été associé dans la littérature à des processus neurodégénératifs, à des dysfonctionnements métaboliques et à des phénotypes liés aux tumeurs, faisant de SMPD3 une cible utile pour la génomique fonctionnelle orientée vers l’étude de voies.

N-SMase2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SMPD3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

N-SMase2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SMPD3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SMPD3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de N-SMase2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SMPD3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de N-SMase2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie N-SMase2 dans les cellules tumorales présentant une expression de SMPD3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.