N-Myc CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400253-ACT

MYCN kodiert den humanen Transkriptionsfaktor N‑Myc, ein basisches Helix‑Loop‑Helix‑Leucinzipper‑Protein, das mit MAX Heterodimere bildet, um an E‑Box‑Regulationselemente zu binden und umfangreiche Genexpressionsprogramme zu koordinieren. N‑Myc trägt zur Regulation des Zellzyklusfortschritts, der Ribosomenbiogenese, des Stoffwechsels, von Antworten auf DNA‑Replikationsstress sowie des Differenzierungszustands bei – durch Integration in die MYC/MAX‑Netzwerkaktivität und die Rekrutierung chromatinassoziierter Kofaktoren. Eine fehlregulierte MYCN‑Expression ist in mehreren Tumorkontexten mit veränderter Proliferationsfähigkeit und veränderten Linien‑/Zellschicksalsprogrammen verknüpft und macht MYCN zu einem häufig genutzten Knotenpunkt zur Untersuchung onkogener transkriptioneller Schaltkreise. Seine nachgeschalteten Effekte auf die Transkription durch RNA‑Polymerase II, die Chromatinzugänglichkeit und wachstumsfaktorabhängige Signalwege liefern messbare Readouts für mechanistische Forschung.

N-Myc Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MYCN-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

N-Myc Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MYCN-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MYCN-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen N-Myc-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MYCN-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von N-Myc-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des N-Myc-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MYCN-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.