Plasmide CRISPR d'Activation (h) Myosin Va: sc-402108-ACT

MYO5A code la protéine motrice à base d’actine myosine Va, une myosine processive qui couple l’hydrolyse de l’ATP au transport à longue distance d’organites membranaires et de complexes protéiques le long des filaments d’actine. Dans les cellules humaines, la myosine Va soutient le trafic vésiculaire, l’acheminement endo-/exocytique et la livraison polarisée des cargos, contribuant à l’organisation du cytosquelette et au contrôle spatial de la signalisation à la périphérie cellulaire. Le transport dépendant de MYO5A s’articule avec des voies régulées par des GTPases Rab et avec la fusion membranaire médiée par les SNARE pour positionner des granules sécrétoires, des récepteurs et des assemblages d’ARNm/protéines. Une perturbation ou une dérégulation de MYO5A a été associée à des défauts de transport intracellulaire susceptibles d’affecter la fonction neuronale et la biologie liée à la pigmentation, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques de phénotypes pathologiques liés au trafic.

Myosin Va Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MYO5A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Myosin Va Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MYO5A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MYO5A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Myosin Va. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MYO5A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Myosin Va au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Myosin Va dans les cellules tumorales présentant une expression de MYO5A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.