MYL9 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401577-ACT

MYL9 kodiert die Myosin-Leichtkette 9, eine regulatorische Leichtkette, die die Motoraktivität des nichtmuskulären Myosin II durch phosphorylierungsabhängige Kontrolle der Aktomyosin-Kontraktilität moduliert. MYL9 wirkt nachgeschaltet von RHOA/ROCK- sowie Ca2+/Calmodulin–MLCK-Signalwegen und beeinflusst dadurch die Bildung von Stressfasern, die Dynamik fokaler Adhäsionen, die Zytokinese und die Spannung an Zell-Zell-Kontakten. Durch die Prägung der zytoskelettalen Mechanik trägt MYL9 zur Zellmigration und zu gefäßglattmuskelähnlichen kontraktilen Programmen in stromalen und endothelialen Kontexten bei. Eine fehlregulierte MYL9-assoziierte Kontraktilität wurde mit pathologischen Umbauprozessen in Verbindung gebracht, die für Fibrose, vaskuläre Dysfunktion und Veränderungen der Tumormikroumgebung relevant sind.

MYL9 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MYL9-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MYL9 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MYL9-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MYL9-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MYL9-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MYL9-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MYL9-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MYL9-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MYL9-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.