MYH4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400467-ACT

MYH4 kodiert die Myosin-Schwerkette 4, einen kontraktilen Motor der schnell zuckenden Skelettmuskulatur, der mit Aktin zusammenwirkt, um über ATP-abhängiges Querbrücken-Zyklieren Kraft zu erzeugen. Als Kernbestandteil der sarkomerischen dicken Filamente trägt MYH4 zur Myofibrillenassemblierung, zur Festlegung des Fasertyps sowie zu Muskel-Leistungsprogrammen bei, die durch Calcium-Handling und metabolische Signalnetzwerke reguliert werden. Obwohl MYH4 vor allem in der Physiologie der schnellen Skelettmuskulatur charakterisiert ist, sind eine veränderte Expression von Myosin-Isoformen und ein Umbau der Sarkomere wiederkehrende Merkmale neuromuskulärer und myopathischer Krankheitszustände, was seine Nutzung als Marker und mechanistischer Knotenpunkt in Studien der Muskelbiologie stützt. Die Modulation der MYH4-Expression bietet einen gut handhabbaren Ansatz, um Signalwege zu untersuchen, die Kontraktilität, Muskelanpassung und Stressantworten in humanen Zellmodellen steuern.

MYH4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MYH4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MYH4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MYH4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MYH4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MYH4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MYH4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MYH4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MYH4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MYH4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.