Plasmide CRISPR d'Activation (h) MTHFD2: sc-403474-ACT

Le gène humain **MTHFD2** code une déshydrogénase/cyclohydrolase mitochondriale NAD‑dépendante de la méthylènetétrahydrofolate, qui soutient le réseau des unités monocarbonées médié par les folates. Cette enzyme contribue à la production mitochondriale de formiate et à l’équilibre rédox, fournissant ainsi des unités à un carbone pour la biosynthèse cytosolique des nucléotides et les réactions de méthylation essentielles aux cellules en prolifération. L’activité de MTHFD2 est étroitement liée au métabolisme sérine–glycine, à la synthèse des purines et du thymidylate, ainsi qu’aux réponses au stress mitochondrial. Une expression dérégulée de MTHFD2 est fréquemment associée à des états métaboliques modifiés dans le cancer et d’autres pathologies liées à la prolifération, ce qui en fait un nœud pertinent pour étudier la reprogrammation métabolique et le contrôle de la croissance.

MTHFD2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MTHFD2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MTHFD2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MTHFD2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MTHFD2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MTHFD2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MTHFD2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MTHFD2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MTHFD2 dans les cellules tumorales présentant une expression de MTHFD2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.