Plásmido CRISPR de Activación (h) MRP5: sc-402443-ACT

ABCC5 codifica el transportador humano de la familia ATP-binding cassette MRP5 (ABCC5), una bomba de eflujo de membrana plasmática que exporta nucleótidos cíclicos como cGMP y cAMP, así como determinados análogos de nucleósidos y aniones orgánicos. Al controlar las reservas intracelulares de nucleótidos cíclicos, MRP5 puede influir en la señalización cGMP/PKG y cAMP/PKA, con efectos posteriores sobre la regulación del tono vascular, la reactividad plaquetaria y las respuestas celulares al estrés. La expresión de ABCC5 y la actividad del transportador se analizan con frecuencia en el contexto del manejo de xenobióticos y de fenotipos de resistencia a múltiples fármacos, donde una capacidad de eflujo alterada puede modificar la exposición intracelular a metabolitos y análogos de fármacos. La desregulación de ABCC5 se ha asociado con cambios relevantes para la enfermedad en la señalización y la homeostasis del transporte, lo que la convierte en un objetivo útil para estudios mecanísticos de la regulación mediada por transportadores.

MRP5 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ABCC5 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

MRP5 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ABCC5 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ABCC5, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de MRP5. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ABCC5 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de MRP5 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía MRP5 en células tumorales con expresión de ABCC5 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.