Plasmide CRISPR d'Activation (h) MRP4: sc-401912-ACT

Le gène humain **ABCC4** code **MRP4** (multidrug resistance-associated protein 4), un transporteur de la famille des cassettes de liaison à l’ATP (ABC) qui assure l’efflux, dépendant de l’ATP, d’anions organiques, notamment des nucléotides cycliques (AMPc/GMPc), des prostaglandines, des leucotriènes, des conjugués d’acides biliaires et de divers métabolites xénobiotiques. En régulant des seconds messagers intracellulaires et des médiateurs lipidiques, MRP4 influence la signalisation des GPCR, les voies de l’homéostasie inflammatoire et vasculaire, ainsi que les réponses cellulaires au stress. L’activité d’ABCC4 façonne aussi la pharmacocinétique et l’exposition cellulaire aux analogues de nucléosides et à d’autres petites molécules via une clairance dépendante du transport. Une expression dérégulée d’ABCC4/MRP4 a été associée à des altérations de la signalisation inflammatoire et à des phénotypes de réponse aux médicaments liés aux transporteurs dans de multiples contextes pathologiques, ce qui en fait une cible utile pour des études mécanistiques de la biologie des transporteurs et des interactions entre voies de signalisation.

MRP4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ABCC4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MRP4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ABCC4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ABCC4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MRP4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ABCC4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MRP4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MRP4 dans les cellules tumorales présentant une expression de ABCC4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.