Plasmide CRISPR d'Activation (h) MREG: sc-405725-ACT

Le gène humain **MREG** (mélanoréguline) code une petite protéine associée aux membranes, impliquée dans la biogenèse des mélanosomes et le transport des granules pigmentaires, influençant la maturation et la distribution des organites apparentés aux lysosomes. MREG participe à des processus de trafic intracellulaire qui se recoupent avec la dynamique endosomale–lysosomale et le transport dépendant du cytosquelette, modulant le positionnement des organites et la prise en charge de leur cargaison. Par ses rôles dans la biologie de la pigmentation et l’homéostasie des organites, une activité altérée de MREG est pertinente pour l’étude des phénotypes pigmentaires et, plus largement, des défauts des voies de transport vésiculaire. Ces fonctions font de MREG un point d’entrée utile pour disséquer les mécanismes de maturation des organites, de tri du cargo et les réponses cellulaires aux perturbations du trafic.

MREG Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MREG sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MREG Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MREG dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MREG, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MREG. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MREG natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MREG au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MREG dans les cellules tumorales présentant une expression de MREG silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.