Plasmide CRISPR d'Activation (h) MLL2: sc-401659-ACT

KMT2D (MLL2) code une méthyltransférase des lysines des histones contenant un domaine SET, qui catalyse la mono‑ et la di‑méthylation de H3K4 au niveau des enhancers, modulant l’accessibilité de la chromatine et des programmes transcriptionnels spécifiques de lignée. Via ses interactions avec des complexes de type COMPASS, MLL2 coordonne l’activation des enhancers, le recrutement de l’ARN polymérase II et une régulation génique à longue distance, essentiels au développement et à l’identité cellulaire. La perturbation du contrôle épigénétique associé à KMT2D est liée à des états de différenciation altérés, à des réponses aux dommages de l’ADN et à une dérégulation transcriptionnelle étendue observées dans de multiples cancers et maladies du développement. En tant que régulateur des paysages d’enhancers, KMT2D est largement étudié dans des voies impliquées dans la détermination du destin cellulaire, la signalisation immunitaire et le contrôle, dépendant de la chromatine, de la prolifération.

MLL2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KMT2D sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MLL2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KMT2D dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KMT2D, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MLL2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KMT2D natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MLL2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MLL2 dans les cellules tumorales présentant une expression de KMT2D silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.