Plasmide CRISPR d'Activation (m) MLH3: sc-432245-ACT

Mlh3 code pour MLH3, un facteur de réparation des mésappariements de l’ADN de la famille MutL, qui forme un hétérodimère avec MLH1 et contribue au maintien du génome via la réparation des mésappariements et la recombinaison méiotique. En méiose, le complexe MLH1–MLH3 favorise la formation de crossing-over de classe I, tandis que dans les cellules somatiques il participe à la surveillance post-réplicative, limitant l’accumulation de mutations et préservant la stabilité chromosomique. MLH3 s’interface également avec des voies de réponse au stress réplicatif et aux dommages à l’ADN, reliant la capacité de réparation à la progression du cycle cellulaire. Une altération de la fonction de MLH3 a été associée à des défauts de réparation des mésappariements, à des phénotypes d’instabilité génomique et à une susceptibilité à des processus pathologiques induits par les mutations, pertinents pour la biologie du cancer et la recherche en génétique de la reproduction.

MLH3 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Mlh3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MLH3 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Mlh3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Mlh3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MLH3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Mlh3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MLH3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MLH3 dans les cellules tumorales présentant une expression de Mlh3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.