Plasmide CRISPR d'Activation (h) MITF: sc-400401-ACT

Le facteur de transcription associé à la microphtalmie (MITF) est un facteur de transcription bHLH-LZ déterminant de lignée, qui régule des programmes contrôlant le développement, la pigmentation, la survie et la différenciation des mélanocytes. Dans les cellules humaines, MITF intègre des signaux issus de voies telles que MAPK/ERK et AMPc/PKA afin de coordonner la transcription de gènes impliqués dans la biogenèse des mélanosomes, les réponses au stress oxydatif, la fonction lysosomale et le métabolisme cellulaire. Une activité de MITF dérégulée a été associée à des états cellulaires mélanocytaires altérés, à des troubles de la pigmentation et à la biologie du mélanome, où des modifications des réseaux transcriptionnels dépendants de MITF peuvent influencer la prolifération, l’invasion et l’adaptation au stress. En tant que nœud transcriptionnel central, MITF est largement utilisé comme outil moléculaire pour étudier l’identité cellulaire, la plasticité transcriptionnelle et la régulation génique dépendante des signaux.

MITF Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MITF sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MITF Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MITF dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MITF, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MITF. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MITF natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MITF au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MITF dans les cellules tumorales présentant une expression de MITF silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.