Plasmide CRISPR d'Activation (h) MIST1: sc-402094-ACT

BHLHA15 code pour MIST1, un facteur de transcription de type hélice–boucle–hélice basique (bHLH) qui pilote la maturation et l’architecture sécrétoire des cellules exocrines professionnelles, notamment dans les lignages des cellules acinaires pancréatiques, des cellules principales gastriques et des glandes salivaires. MIST1 coordonne des programmes transcriptionnels qui soutiennent l’exocytose régulée, la polarité apico-basale et l’expansion du réticulum endoplasmique ainsi que du réseau de granules de sécrétion, en interagissant avec des voies contrôlant l’homéostasie du RE et la différenciation. Une activité altérée de MIST1 a été associée à la dédifférenciation des cellules exocrines, aux réponses de stress des acini et à la plasticité de lignage lors du remodelage inflammatoire. Ces caractéristiques font de BHLHA15 un nœud utile pour étudier les états de différenciation épithéliale et les dysfonctionnements des tissus sécrétoires pertinents pour les changements associés à la pancréatite et les modèles de tumorigenèse pancréatique.

MIST1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BHLHA15 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MIST1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BHLHA15 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BHLHA15, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MIST1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BHLHA15 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MIST1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MIST1 dans les cellules tumorales présentant une expression de BHLHA15 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.