Plasmide CRISPR d'Activation (h) MIA3: sc-403994-ACT

La protéine humaine MIA3 (melanoma inhibitory activity family member 3), également appelée TANGO1, est une protéine d’échafaudage résidente du réticulum endoplasmique (RE) essentielle à l’organisation des sites de sortie du RE et au couplage de l’assemblage du manteau COPII à la sécrétion de cargaisons volumineuses. En coordonnant le chargement du procollagène et la biogenèse des vésicules, MIA3 soutient le dépôt de la matrice extracellulaire et l’homéostasie tissulaire, reliant la protéostase du RE à la capacité de la voie sécrétoire. Le trafic dépendant de MIA3 recoupe la biosynthèse du collagène, la signalisation de la réponse aux protéines mal repliées (UPR) et les programmes de remodelage stromal. Une activité dérégulée de MIA3 a été associée à une organisation altérée de la matrice et à des phénotypes de stress sécrétoire pertinents pour la fibrose, des anomalies du développement et la biologie du microenvironnement tumoral.

MIA3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MIA3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MIA3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MIA3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MIA3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MIA3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MIA3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MIA3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MIA3 dans les cellules tumorales présentant une expression de MIA3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.