Plasmide CRISPR d'Activation (h) MGMT: sc-400720-ACT

MGMT (O6‑méthylguanine‑ADN méthyltransférase) est une protéine de réparation de l’ADN conservée qui élimine les adduits alkylés en position O6 de la guanine par un mécanisme de réversion directe, rétablissant la fidélé de l’appariement des bases et limitant la mutagenèse. En tant qu’enzyme « suicide » qui transfère le groupement alkyle sur une cystéine du site actif, MGMT influence les réponses cellulaires au stress d’alkylation endogène et exogène et s’articule avec les programmes de maintenance du génome qui modulent la progression du cycle cellulaire et la signalisation des dommages à l’ADN. Des variations de l’expression de MGMT et de la régulation de son promoteur ont été associées à une susceptibilité modifiée à l’accumulation de mutations et à l’instabilité génomique dans de multiples contextes pathologiques, ce qui en fait un nœud clé pour l’étude de la capacité de réparation de l’ADN. MGMT est également largement utilisé comme lecture fonctionnelle dans les voies qui gouvernent la tolérance au stress génotoxique et le contrôle épigénétique de l’expression des gènes de réparation de l’ADN.

MGMT Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MGMT sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MGMT Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MGMT dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MGMT, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MGMT. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MGMT natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MGMT au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MGMT dans les cellules tumorales présentant une expression de MGMT silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.