METTL3 Plasmide di attivazione CRISPR (bovine): sc-437359-ACT

METTL3 codifica il nucleo catalitico del complesso metiltransferasico dell’RNA N6-metiladenosina (m6A), un importante regolatore epitranscrittomico del destino di mRNA e RNA non codificanti nelle cellule bovine. Depositando marcature m6A, METTL3 influenza lo splicing dell’RNA, l’esportazione nucleare, l’efficienza di traduzione e la stabilità dei trascritti, integrandosi con vie che governano la progressione del ciclo cellulare, i programmi di differenziamento, le risposte allo stress e la segnalazione immunitaria innata. Un’attività alterata di METTL3 è ampiamente associata a reti di espressione genica deregolate e a fenotipi rilevanti per la trasformazione oncogenica, la segnalazione infiammatoria e difetti dello sviluppo in diverse specie. Nei modelli biomedici e comparativi bovini, la modulazione di METTL3 supporta studi meccanicistici sul controllo, dipendente dalla metilazione dell’RNA, dello stato cellulare e dei circuiti di regolazione genica.

METTL3 Il plasmide di attivazione CRISPR (bovine) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

METTL3 Il plasmide di attivazione CRISPR (bovine) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione , dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di METTL3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da METTL3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via METTL3 nelle cellule tumorali con espressione di silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.