Plasmide CRISPR d'Activation (h) Metallothionein 2A: sc-410889-ACT

MT2A code la métallothionéine 2A, une protéine riche en cystéines capable de lier les métaux, qui tamponne le zinc et le cuivre intracellulaires, séquestre des métaux lourds toxiques tels que le cadmium et contribue au maintien de l’homéostasie redox cellulaire. En régulant la disponibilité des métaux, MT2A influence des programmes transcriptionnels dépendants des métaux ainsi que les réponses antioxydantes, à l’interface des voies de signalisation du stress et des processus de détoxification. L’expression de MT2A est inductible par le stress oxydant, des signaux inflammatoires et l’exposition aux métaux, ce qui la relie à des voies qui gouvernent la survie cellulaire et l’adaptation aux agressions environnementales. Une dérégulation de la biologie des métallothionéines a été associée à des altérations du métabolisme des métaux et de la tolérance au stress observées dans divers cancers, des contextes neurodégénératifs et des modèles de lésion hépatique, faisant de MT2A un point d’entrée utile pour des études mécanistiques de la signalisation sensible aux métaux.

Metallothionein 2A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MT2A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Metallothionein 2A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MT2A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MT2A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Metallothionein 2A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MT2A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Metallothionein 2A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Metallothionein 2A dans les cellules tumorales présentant une expression de MT2A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.