Plasmide CRISPR d'Activation (h) MCT3: sc-403973-ACT

SLC16A8 code le transporteur de monocarboxylates 3 (MCT3), un transporteur couplé aux protons qui assure le flux transmembranaire du lactate et d’autres monocarboxylates à chaîne courte afin de soutenir l’équilibre rédox cellulaire et l’homéostasie du pH. L’activité de MCT3 contribue au couplage métabolique entre les cellules en facilitant la prise en charge du lactate et s’inscrit à l’interface des métabolismes glycolytique et oxydatif, influençant l’acidification intracellulaire et la disponibilité des substrats énergétiques. Dans l’œil humain, SLC16A8 est enrichi dans l’épithélium pigmentaire rétinien, où il favorise l’efflux de lactate depuis la rétine externe et aide à maintenir le microenvironnement métabolique des photorécepteurs. Des variations génétiques et une expression modifiée de SLC16A8 ont été associées, dans des études génétiques chez l’humain, à des phénotypes de dégénérescence rétinienne et à un risque accru de dégénérescence maculaire liée à l’âge, ce qui motive l’étude mécanistique du transport du lactate dans la santé rétinienne et les réponses au stress.

MCT3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC16A8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MCT3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC16A8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC16A8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MCT3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC16A8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MCT3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MCT3 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC16A8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.