Plasmide CRISPR d'Activation (h) Mcl-1: sc-400079-ACT

MCL1 code pour Mcl-1, une protéine anti-apoptotique de la famille BCL-2 qui se localise principalement à la membrane externe des mitochondries et inhibe la perméabilisation de cette membrane en séquestrant des facteurs pro-apoptotiques « BH3-only » et en empêchant l’activation de BAX/BAK. Son abondance est étroitement régulée par un renouvellement rapide et par des signaux provenant de voies telles que PI3K–AKT, MAPK/ERK et JAK/STAT, ce qui permet un contrôle dynamique de l’apoptose intrinsèque au cours de la prolifération, de la différenciation et des réponses au stress cellulaire. Mcl-1 contribue aussi à l’homéostasie mitochondriale et a été associée à la régulation de l’autophagie et de l’adaptation métabolique. Une expression dérégulée de MCL1 est fréquemment liée, dans le cancer, à des programmes de survie cellulaire altérés et influence la résistance à des agressions génotoxiques et à des perturbations ciblées, ce qui en fait un nœud clé pour l’étude de l’apoptose, de la signalisation de stress et des dépendances de survie.

Mcl-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MCL1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Mcl-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MCL1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MCL1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Mcl-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MCL1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Mcl-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Mcl-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de MCL1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.