Plasmide CRISPR d'Activation (h) MC1-R: sc-402152-ACT

MC1R code le récepteur de la mélanocortine 1 (MC1‑R), un récepteur couplé aux protéines G principalement exprimé dans les mélanocytes, où il régule la synthèse de mélanine et le basculement des pigments. Après liaison de mélanocortines telles que l’α‑MSH, MC1‑R active l’adénylate cyclase ainsi que la signalisation AMPc/PKA, favorisant des programmes transcriptionnels dépendants de MITF qui soutiennent la mélanogenèse, les réponses aux dommages de l’ADN et la résistance au stress oxydant. Les variations ou une activité altérée de MC1R sont associées à des phénotypes de pigmentation et sont largement étudiées dans le contexte de la biologie de la réponse aux UV et de la transformation des mélanocytes. Ces propriétés font de MC1‑R un nœud utile pour étudier la signalisation des GPCR, la transcription induite par l’AMPc et l’homéostasie des cellules pigmentaires dans des modèles cellulaires humains.

MC1-R Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MC1R sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MC1-R Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MC1R dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MC1R, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MC1-R. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MC1R natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MC1-R au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MC1-R dans les cellules tumorales présentant une expression de MC1R silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.