MBNL2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401921-ACT

Humanes MBNL2 (muscleblind-like splicing regulator 2) ist ein RNA-bindendes Protein, das alternatives prä-mRNA-Spleißen, mRNA-Lokalisierung und Transkriptstabilität steuert, indem es YGCY-reiche Motive in Ziel-RNAs erkennt. Es trägt zur Koordination gewebs- und entwicklungsspezifischer Isoformprogramme bei, die die Zytoskelettorganisation, die Zelldifferenzierung und die stressresponsive RNA-Verarbeitung beeinflussen. Eine Fehlregulation der Aktivität der MBNL-Familie steht in engem Zusammenhang mit aberranten Spleißumschaltungen, wie sie bei der myotonen Dystrophie und anderen Repeat-Expansion-Erkrankungen beobachtet werden, und veränderte MBNL2-abhängige Spleißnetzwerke wurden mit neuromuskulären und neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen in Verbindung gebracht. Die Modulation der MBNL2-Spiegel ist daher nützlich, um Schaltkreise von Spleißfaktoren, Wege des RNA-Metabolismus und isoformspezifische Mechanismen in humanen Zellmodellen zu untersuchen.

MBNL2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MBNL2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MBNL2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MBNL2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MBNL2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MBNL2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MBNL2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MBNL2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MBNL2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MBNL2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.