Plasmide CRISPR d'Activation (h) MBD4: sc-403156-ACT

La MBD4 humaine (methyl-CpG binding domain protein 4) est une glycosylase de l’ADN qui reconnaît les mésappariements T:G et U:G issus de la désamination au niveau des sites CpG méthylés et initie la réparation par excision de base afin de maintenir l’intégrité du génome. En couplant la reconnaissance des méthyl-CpG à l’excision de la lésion, MBD4 relie le contexte épigénétique à la réparation de l’ADN et contribue à limiter l’accumulation de mutations aux dinucléotides CpG. L’activité de MBD4 s’articule avec des processus de réparation associés à la réplication et de réponse aux dommages qui façonnent les spectres mutationnels et la stabilité chromosomique. Une altération de la fonction ou de l’expression de MBD4 a été associée à des phénotypes d’hypermutation et à une instabilité génomique observés dans divers contextes pertinents pour le cancer, ce qui appuie son utilité pour l’étude des mécanismes de mutagenèse.

MBD4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MBD4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MBD4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MBD4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MBD4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MBD4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MBD4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MBD4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MBD4 dans les cellules tumorales présentant une expression de MBD4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.