Plasmide CRISPR d'Activation (h) MBD3: sc-401072-ACT

Le gène humain **MBD3** code la protéine 3 à domaine de liaison au méthyl-CpG, un composant central du complexe **NuRD** (remodelage des nucléosomes et désacétylation) qui associe le remodelage de la chromatine dépendant de l’ATP à la désacétylation des histones afin de réguler les programmes transcriptionnels. MBD3 contribue au contrôle épigénétique de l’identité cellulaire, notamment lors de la différenciation et des transitions de pluripotence, en coordonnant la répression ou la mise en attente de gènes au niveau des promoteurs et des enhancers et en influençant l’accessibilité de la chromatine. Par son rôle dans l’organisation de la chromatine, MBD3 s’articule avec des voies impliquées dans la réponse aux dommages de l’ADN, le calendrier de réplication et les réseaux de gènes du développement. Une activité dérégulée de NuRD/MBD3 a été associée à des états transcriptionnels aberrants dans le cancer et à des phénotypes neurodéveloppementaux, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude des mécanismes épigénétiques à l’origine de modifications de l’expression génique liées aux maladies.

MBD3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MBD3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MBD3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MBD3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MBD3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MBD3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MBD3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MBD3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MBD3 dans les cellules tumorales présentant une expression de MBD3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.