MARK4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404386-ACT

MARK4 (microtubule affinity-regulating kinase 4) ist eine Serin/Threonin-Kinase der AMPK-verwandten MARK-Familie, die die Mikrotubuli-Stabilität durch Phosphorylierung mikrotubuliassoziierter Proteine wie TAU/MAPT moduliert. Über die Regulation der Zytoskelettdynamik trägt MARK4 zur Zellpolarität, zum intrazellulären Transport und zu mitotischen Prozessen bei und ist in Signalnetzwerke eingebunden, die Stress- und Stoffwechselreize mit dem Umbau von Mikrotubuli koordinieren. Eine fehlregulierte MARK4-Aktivität wurde mit einer veränderten Organisation neuronaler Mikrotubuli in Verbindung gebracht und in Kontexten der Neurodegeneration untersucht, ebenso wie bei krebsassoziierten Phänotypen einschließlich Veränderungen von Proliferation und Migration. Diese Eigenschaften machen MARK4 zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien mikrotubuliabhängiger Signalwege und der kinasegesteuerten zellulären Organisation.

MARK4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MARK4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MARK4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MARK4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MARK4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MARK4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MARK4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MARK4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MARK4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MARK4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.