Plasmide CRISPR d'Activation (h) MARCKS: sc-400837-ACT

Le substrat de la protéine kinase C riche en alanine et myristoylé (MARCKS) est un substrat majeur de la PKC qui s’associe à la membrane plasmique et au cytosquelette d’actine afin de réguler la forme cellulaire, l’adhésion et la motilité. En se liant au phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) et en réticulant la F-actine, MARCKS influence le trafic membranaire, l’exocytose/l’endocytose et la transduction du signal en aval de la PKC et du Ca2+/calmoduline. Le remodelage du cytosquelette dépendant de MARCKS est impliqué dans la croissance des neurites et la plasticité synaptique, ainsi que dans la migration des cellules immunitaires et la signalisation inflammatoire. Une expression ou une phosphorylation dérégulée de MARCKS a été rapportée dans des contextes de biologie du cancer, de neuroinflammation et de maladies pulmonaires, ce qui appuie son utilisation comme nœud mécanistique dans les études de migration, d’invasion et de signalisation dépendante des stimuli.

MARCKS Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MARCKS sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MARCKS Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MARCKS dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MARCKS, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MARCKS. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MARCKS natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MARCKS au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MARCKS dans les cellules tumorales présentant une expression de MARCKS silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.