Plasmide CRISPR d'Activation (h) MAF1: sc-418170-ACT

MAF1 humain code un répresseur transcriptionnel conservé qui couple les signaux liés aux nutriments et au stress à l’activité de l’ARN polymérase III, régulant ainsi la synthèse des ARNt, de l’ARNr 5S et d’autres petits ARN non codants essentiels à la traduction des protéines et à la croissance cellulaire. L’activité de MAF1 est contrôlée par phosphorylation en aval de mTORC1 et de kinases apparentées, intégrant l’état métabolique à des programmes transcriptionnels qui façonnent la protéostasie et l’adaptation au stress cellulaire. Par son influence sur la capacité de traduction, MAF1 contribue à des voies qui régissent la prolifération, l’équilibre énergétique et les réponses au stress. La dérégulation de la transcription par Pol III et de ses régulateurs en amont a été associée à des phénotypes oncogéniques et métaboliques, ce qui motive des études mécanistiques du contrôle transcriptionnel dépendant de MAF1 dans des contextes pertinents pour la maladie.

MAF1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de MAF1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MAF1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus MAF1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription MAF1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MAF1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus MAF1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MAF1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MAF1 dans les cellules tumorales présentant une expression de MAF1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.