Lsh Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420828-ACT

Mouse Hells codifica a helicase específica de linfócitos (Lsh), um remodelador de cromatina dependente de ATP da família SNF2 que regula o posicionamento de nucleossomos, a estrutura de cromatina de ordem superior e os padrões de metilação do DNA em todo o genoma. A Lsh ajuda a manter o silenciamento epigenético em elementos repetitivos e influencia programas de transcrição durante o desenvolvimento, a diferenciação e a progressão do ciclo celular por meio do controle da acessibilidade da cromatina. Ela está funcionalmente ligada a vias que governam a formação de heterocromatina, a montagem de cromatina acoplada à replicação e a repressão de elementos transponíveis, contribuindo assim para a estabilidade do genoma. A desregulação da remodelação epigenética associada a HELLS/Lsh tem sido implicada em paisagens de metilação aberrantes e em fenótipos de instabilidade cromossômica relevantes para a biologia do câncer e a pesquisa em neurodesenvolvimento.

Lsh O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Hells sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Lsh O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Hells em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Hells, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Lsh. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Hells nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Lsh no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Lsh em células tumorais com expressão de Hells silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.