Plásmido CRISPR de Activación (h) LRRC59: sc-404821-ACT

LRRC59 (repeticiones ricas en leucina que contiene 59) codifica una proteína de membrana asociada al retículo endoplásmico y a la envoltura nuclear, implicada en la direccionamiento de proteínas y en el tráfico asociado a membranas en la cara citoplasmática del RE. LRRC59 se ha relacionado con el reclutamiento de ribosomas y con procesos cotraduccionales que respaldan la biogénesis de proteínas secretoras y de membrana, conectándola con las redes de homeostasis del RE y de proteostasis. Debido a su localización en la interfaz RE–envoltura nuclear, LRRC59 también se estudia en el contexto de la organización nucleo-citoplasmática y de la remodelación del sistema endomembranoso en respuesta al estrés. La proteostasis del RE desregulada y los programas de tráfico alterados son características recurrentes en la investigación sobre cáncer y neurodegeneración, lo que convierte a LRRC59 en un nodo útil para desentrañar cambios a nivel de vías en estos procesos relevantes para la enfermedad.

LRRC59 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de LRRC59 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

LRRC59 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus LRRC59 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional LRRC59, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de LRRC59. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo LRRC59 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de LRRC59 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía LRRC59 en células tumorales con expresión de LRRC59 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.