Plasmide CRISPR d'Activation (h) LRF/Pokemon: sc-402016-ACT

ZBTB7A code le facteur de transcription LRF/Pokemon, une protéine à doigts de zinc de type BTB/POZ qui régule des programmes d’expression génique contrôlant le destin cellulaire, la prolifération et la différenciation. LRF/Pokemon participe à la répression et à l’activation transcriptionnelles associées à la chromatine, influençant les choix de lignée dans les contextes hématopoïétiques et d’autres processus du développement, tout en s’articulant avec des voies impliquées dans le contrôle du cycle cellulaire et les réponses au stress. Une activité dérégulée de ZBTB7A a été associée à des réseaux transcriptionnels altérés en biologie du cancer ainsi qu’à des perturbations du développement des cellules érythroïdes et immunitaires, ce qui en fait un nœud utile pour étudier les circuits des facteurs de transcription oncogéniques. L’étude de la fonction de ZBTB7A soutient des travaux mécanistiques sur la régulation des promoteurs et des enhancers, les transitions d’états épigénétiques et le remaniement transcriptionnel dépendant du contexte.

LRF/Pokemon Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ZBTB7A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

LRF/Pokemon Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ZBTB7A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ZBTB7A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de LRF/Pokemon. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ZBTB7A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de LRF/Pokemon au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie LRF/Pokemon dans les cellules tumorales présentant une expression de ZBTB7A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.