Plasmide CRISPR d'Activation (h) LITAF: sc-404337-ACT

LITAF (facteur TNF induit par les lipopolysaccharides) est un régulateur transcriptionnel impliqué dans la signalisation de l’immunité innée et l’expression de gènes inflammatoires, notamment via la modulation du TNF et d’autres programmes dépendants des cytokines. La protéine s’interface avec des voies de détection du stress et des agents pathogènes et contribue à des processus de trafic endosomal/lysosomal qui façonnent le renouvellement des récepteurs et les sorties de signalisation en aval. Une activité altérée de LITAF a été associée à une inflammation dérégulée et à des réponses cellulaires au stress, et des perturbations génétiques ont été liées à des phénotypes neuropathiques et immunitaires. Ces caractéristiques font de LITAF un nœud utile pour étudier le contrôle transcriptionnel des réseaux de cytokines, l’interconnexion entre trafic membranaire et inflammation, ainsi que la régulation contextuelle de l’homéostasie immunitaire.

LITAF Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de LITAF sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

LITAF Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus LITAF dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription LITAF, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de LITAF. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus LITAF natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de LITAF au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie LITAF dans les cellules tumorales présentant une expression de LITAF silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.