Plasmide CRISPR d'Activation (h) LIMK-1: sc-401057-ACT

LIMK1 code la protéine LIMK‑1, une kinase sérine/thréonine qui phosphoryle et inactive la cofiline afin de réguler le renouvellement des filaments d’actine et le remodelage du cytosquelette. Via la signalisation des petites GTPases de la famille Rho, notamment par les voies ROCK et PAK, LIMK‑1 coordonne les changements de forme cellulaire, la dynamique d’adhérence et la motilité, influençant des processus tels que la croissance des neurites et la plasticité synaptique. Une activité dérégulée de LIMK‑1 a été associée à des altérations de la dynamique de l’actine observées dans des modèles d’invasion et de métastases de cellules cancéreuses, ainsi qu’à des phénotypes neurodéveloppementaux et cognitifs. En tant qu’effecteur du remodelage de l’actine, LIMK‑1 est fréquemment étudiée dans les voies qui contrôlent la migration, la mécanotransduction et la formation de fibres de stress.

LIMK-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de LIMK1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

LIMK-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus LIMK1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription LIMK1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de LIMK-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus LIMK1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de LIMK-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie LIMK-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de LIMK1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.