LASS6 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403901-ACT

CERS6 kodiert die Ceramid-Synthase 6 (LASS6), ein Enzym der Membran des endoplasmatischen Retikulums, das die N‑Acylierung von Sphinganine/Sphingosin katalysiert und dadurch C16‑Ceramid erzeugt. Durch die Formung zellulärer Ceramid-Pools beeinflusst LASS6 den Sphingolipidstoffwechsel und nachgeschaltete Signalwege, die mit der Organisation von Membran-Mikrodomänen, vesikulärem Transport und stressresponsiven Pfaden verknüpft sind. Eine veränderte CERS6-Aktivität wurde mit einer Dysregulation der Lipidhomöostase sowie mit Veränderungen in Apoptose, Autophagie und inflammatorischer Signalgebung in Verbindung gebracht, was sie für Studien zu metabolischer Dysfunktion und onkogenen Phänotypen relevant macht. In menschlichen Zellen kann die CERS6-abhängige Ceramidzusammensetzung die mitochondriale Integrität und rezeptorvermittelte Signalausgänge modulieren, die Proliferation und Entscheidungen über das Zellschicksal beeinflussen.

LASS6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CERS6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

LASS6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CERS6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CERS6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen LASS6-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CERS6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von LASS6-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des LASS6-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CERS6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.