Plasmide CRISPR d'Activation (h) LAP2: sc-403613-ACT

Le gène humain **TMPO** code la **polypeptide 2 associée à la lamina (LAP2)**, une protéine de la membrane nucléaire interne qui se lie aux lamines et à la chromatine afin d’organiser l’architecture nucléaire et de réguler la stabilité du génome. Les isoformes de LAP2 participent à la réassemblage de l’enveloppe nucléaire après la mitose, à l’ancrage de l’hétérochromatine périphérique et à la coordination des programmes de réplication et de réparation de l’ADN couplés à la progression du cycle cellulaire. Par ces rôles structuraux et régulateurs, TMPO influence la compartimentation transcriptionnelle et l’intégrité nucléaire liée à la mécanotransduction. Une expression ou une localisation altérées de TMPO/LAP2 ont été associées à des défauts de morphologie nucléaire et sont fréquemment étudiées dans les travaux sur les troubles prolifératifs et les voies liées aux laminopathies.

LAP2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TMPO sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

LAP2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TMPO dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TMPO, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de LAP2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TMPO natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de LAP2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie LAP2 dans les cellules tumorales présentant une expression de TMPO silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.