Plásmido CRISPR de Activación (h) L-type Ca⁺⁺ CP α1D: sc-401745-ACT

CACNA1D codifica la subunidad α1D formadora del poro de los canales de calcio tipo L dependientes de voltaje (CaV1.3), que median la entrada de Ca2+ inducida por despolarización en células excitables. CaV1.3 acopla la actividad eléctrica de la membrana a la señalización intracelular dependiente de Ca2+, modulando la descarga de potenciales de acción, la transmisión sináptica y los programas de transcripción regulados por calcio. Mediante su integración con las vías de Ca2+/calmodulina, la señalización calcineurina–NFAT y el acoplamiento excitación–transcripción, CACNA1D influye en la fisiología celular neuronal, endocrina y cardíaca. La variación genética y la actividad desregulada de CACNA1D se han implicado en fenotipos del neurodesarrollo, alteraciones de la función endocrina y perturbaciones de la señalización asociadas a canalopatías relevantes para estudios de mecanismos de enfermedad.

L-type Ca++ CP α1D El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CACNA1D sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

L-type Ca++ CP α1D El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CACNA1D en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CACNA1D, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de L-type Ca++ CP α1D. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CACNA1D y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de L-type Ca++ CP α1D en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía L-type Ca++ CP α1D en células tumorales con expresión de CACNA1D silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.