Plasmide CRISPR d'Activation (h) L-type Ca⁺⁺ CP α1D: sc-401745-ACT

CACNA1D code la sous-unité α1D formant le pore des canaux calciques de type L dépendants du voltage (CaV1.3), qui assurent l’entrée de Ca2+ déclenchée par la dépolarisation dans les cellules excitables. CaV1.3 couple l’activité électrique membranaire à une signalisation intracellulaire dépendante du Ca2+, modulant la décharge des potentiels d’action, la transmission synaptique et les programmes transcriptionnels régulés par le calcium. Par son intégration aux voies Ca2+/calmoduline, à la signalisation calcineurine–NFAT et au couplage excitation–transcription, CACNA1D influence la physiologie cellulaire neuronale, endocrinienne et cardiaque. Des variations génétiques et une activité dérégulée de CACNA1D ont été associées à des phénotypes neurodéveloppementaux, à des altérations de la fonction endocrinienne et à des perturbations de la signalisation liées aux canalopathies, pertinentes pour les études des mécanismes pathogéniques.

L-type Ca++ CP α1D Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CACNA1D sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

L-type Ca++ CP α1D Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CACNA1D dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CACNA1D, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de L-type Ca++ CP α1D. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CACNA1D natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de L-type Ca++ CP α1D au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie L-type Ca++ CP α1D dans les cellules tumorales présentant une expression de CACNA1D silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.