KV4.3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404247-ACT

KCND3 kodiert die menschliche, spannungsabhängige Kaliumkanal‑Untereinheit KV4.3, einen Hauptvermittler schneller, transienter A‑Typ‑Kaliumströme, die die Repolarisation des Aktionspotenzials und die Entladungsfrequenz prägen. Die Funktion von KV4.3 ist in Netzwerke der Membran-Erregbarkeit in Neuronen und Kardiomyozyten eingebunden und beeinflusst synaptische Integration, Leitungsdynamik sowie aktivitätsabhängige Signalübertragung. Durch die Feinabstimmung der Repolarisationskinetik und der Erregbarkeitsschwellen überschneidet sich KCND3 mit Signalwegen, die elektrische Signalgebung, Kalziumkopplung und nachgeschaltete, depolarisationsabhängige Transkriptionsprogramme steuern. Genetische und funktionelle Störungen von KCND3 wurden mit Erkrankungen der Erregbarkeit in Verbindung gebracht, darunter neurologische Phänotypen wie die spinozerebelläre Ataxie sowie kardiale elektrische Auffälligkeiten, was seine Relevanz für mechanistisch ausgerichtete Studien unterstreicht.

KV4.3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KCND3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

KV4.3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KCND3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KCND3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen KV4.3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KCND3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von KV4.3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des KV4.3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KCND3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.