KV1.5 Plásmido CRISPR/Cas9 KO (m): sc-421216

Descripción general

Kcna5 codifica el canal de potasio dependiente de voltaje KV1.5, una subunidad de la familia Kv1 relacionada con Shaker que genera corrientes rectificadoras retardadas y ayuda a establecer el potencial de membrana en reposo y la repolarización del potencial de acción en células excitables. Al modular la excitabilidad de la membrana y, de forma indirecta, la entrada de calcio, KV1.5 influye en el acoplamiento estímulo–secreción, el tono del músculo liso y la remodelación electrofisiológica mediante procesos de homeostasis iónica y de señalización de membrana. La actividad alterada de KCNA5/KV1.5 se ha vinculado con la remodelación eléctrica auricular y fenotipos asociados a arritmias, y también se estudia en contextos vasculares y pulmonares donde la conductancia de K+ modula la contractilidad y la señalización proliferativa. Por ello, en ratón, Kcna5 es una diana útil para desentrañar cómo las corrientes de canales Kv se integran con vías que regulan la excitabilidad, la contracción y las respuestas celulares al estrés.

El plásmido CRISPR/Cas9 KO KV1.5 (m) es un conjunto de plásmidos diseñado para la interrupción selectiva del gen Kcna5 en líneas celulares mouse. Cada plásmido del conjunto coexpresa un ARN guía específico (sgRNA) único, dirigido a un sitio distinto dentro del locus Kcna5, junto con la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes, y codifica GFP para permitir la identificación fluorescente y el enriquecimiento de las células transfectadas con éxito. Esta estrategia multiguía aumenta la probabilidad de inducir desplazamientos de marco de lectura o deleciones que produzcan una inactivación funcional, ofreciendo una alternativa más robusta a los enfoques de guía única. Las DSB inducidas en múltiples sitios se resuelven mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o, cuando se utiliza con la plantilla donante HDR incluida, mediante reparación dirigida por homología (HDR) en un sitio diana definido dentro del locus.

Cuando se utiliza junto con el donante HDR que expresa RFP, la fluorescencia de GFP y RFP puede utilizarse conjuntamente para distinguir las poblaciones de células transfectadas de las editadas, lo que agiliza los flujos de trabajo de clasificación y selección de clones basados en citometría de flujo.

Donante de reparación dirigida por homología (HDR) — Casete de puromicina con reportero RFP

Para aplicaciones que requieren clones knockout confirmados y seleccionables, el plásmido HDR KV1.5 (m) incluye un constructo donante HDR que contiene un casete de resistencia a la puromicina (PuroR) y un reportero de proteína fluorescente roja (RFP), flanqueado por brazos de homología específicos de un sitio diana definido Kcna5.
Cuando se cotransfecciona con el plásmido KV1.5 CRISPR/Cas9 KO (m):

• El casete PuroR-RFP se integra en el sitio de corte de Cas9 mediante HDR, interrumpiendo el marco de lectura abierto Kcna5.
  La fluorescencia de la RFP proporciona un indicador visual inmediato del éxito de la integración, lo que permite la identificación o clasificación basada en la fluorescencia de las células editadas antes o junto con la selección con puromicina.
  Las células editadas con éxito se confirman mediante la resistencia a la puromicina, lo que reduce sustancialmente la carga de cribado de clones.
  Esta estrategia de selección es ideal para generar líneas celulares KO clonales estables para estudios funcionales posteriores, cribado de fármacos o desarrollo de modelos.

Sistema de eliminación del casete Cre-lox

La construcción donante HDR cuenta con sitios loxP que flanquean el casete de selección PuroR-RFP para permitir la eliminación limpia del marcador tras la confirmación del clon. La expresión transitoria de la recombinasa Cre a través del vector Cre: sc-418923 incluido extirpa el casete, dejando un sitio loxP residual mínimo dentro del locus Kcna5 y eliminando posibles efectos de confusión en los ensayos posteriores.
Este enfoque en dos pasos:

• Minimiza la alteración de la arquitectura local de la cromatina y de los elementos reguladores vecinos
  Restaura un contexto genómico casi nativo en el locus editado
  Permite reutilizar la estrategia de selección con puromicina en la misma línea celular para ediciones adicionales

Características principales

• gRNA dirigido a los exones Kcna5 críticos para la función KV1.5
  Coexpresión de SpCas9 y sgRNA a partir de un único plásmido para una administración simplificada
  Donante HDR con resistencia a la puromicina para la selección positiva de clones
  Casete PuroR flanqueado por loxP con vector de recombinasa Cre para la eliminación sin fisuras del marcador
  Se suministra listo para su uso mediante transfección

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.