KRAS CRISPR Activation Plasmid (m): sc-421333-ACT

Kras kodiert die kleine GTPase KRAS, einen zentralen molekularen Schalter, der Signale von aktivierten Rezeptor-Tyrosinkinasen an nachgeschaltete RAF–MEK–ERK- und PI3K–AKT–mTOR-Signalwege weiterleitet. Durch den Wechsel zwischen GDP- und GTP-gebundenen Zuständen reguliert KRAS Proliferation, Differenzierung, Überleben und metabolische Anpassung, wobei dies streng durch GEFs und GAPs kontrolliert wird. Eine fehlregulierte KRAS-Signalgebung stört die Zellzykluskontrolle und Programme der Stressantwort und wird in Mausmodellen häufig eingesetzt, um onkogene Signalnetzwerke, Gewebehomöostase und Interaktionen zwischen Tumor und Mikroumgebung zu untersuchen. Da KRAS vielfältige upstream Signale integriert und breit angelegte transkriptionelle sowie posttranslationale Outputs koordiniert, ist es ein zentraler Knotenpunkt für Pathway-Mapping und Epistasie-Studien.

KRAS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Kras-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

KRAS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Kras-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Kras-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen KRAS-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Kras-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von KRAS-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des KRAS-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Kras-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.