Plasmide CRISPR d'Activation (h) kpm: sc-404134-ACT

Le gène humain **LATS2** code une sérine/thréonine kinase centrale de la voie de signalisation Hippo, qui limite la prolifération cellulaire et favorise l’apoptose en régulant les coactivateurs transcriptionnels **YAP/TAZ**. Grâce à un contrôle de l’activité nucléaire de YAP/TAZ dépendant de la phosphorylation, LATS2 contribue au maintien de l’homéostasie tissulaire, de l’inhibition de contact et de l’intégrité des points de contrôle du cycle cellulaire, avec des liens supplémentaires avec la biologie du centrosome et les réponses au stress. Une altération de la fonction de LATS2 ou une dérégulation de la voie Hippo est fréquemment associée à un contrôle anormal de la croissance et à une instabilité génomique dans divers contextes pertinents pour les maladies, ce qui en fait une cible largement étudiée au sein des réseaux de suppresseurs de tumeurs. En tant que kinase située à un point de convergence de la voie, LATS2 est également utilisée pour étudier les interactions (« crosstalk ») entre la signalisation Hippo, la dynamique du cytosquelette et les programmes transcriptionnels gouvernant des caractéristiques de type épithélio-mésenchymateux.

kpm Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de LATS2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

kpm Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus LATS2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription LATS2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de kpm. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus LATS2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de kpm au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie kpm dans les cellules tumorales présentant une expression de LATS2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.