KMO CRISPR Activation Plasmid (h): sc-418366-ACT

Humanes KMO (Kynurenin-3-Monooxygenase) ist ein flavinabhängiges mitochondriales Enzym im Kynureninweg des Tryptophanabbaus und katalysiert die Umwandlung von L‑Kynurenin zu 3‑Hydroxykynurenin. Indem KMO den Stofffluss zu nachgeschalteten Metaboliten wie 3‑Hydroxyanthranilsäure und Chinolinsäure steuert, beeinflusst es das zelluläre Redoxgleichgewicht, die NAD+-Biosynthese und die neuroimmunologische Signalübertragung. Eine veränderte KMO-Aktivität kann die Spiegel neuroaktiver und oxidativer Metabolite verschieben und verknüpft diesen Stoffwechselweg damit mit entzündungsassoziierten Prozessen und Mechanismen neurologischer Erkrankungen. Die KMO-Expression wird zudem in Zusammenhängen von metabolischem Stress und Immunregulation untersucht, in denen ein Umbau des Kynureninwegs Zellzustandsübergänge beeinflusst.

KMO Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KMO-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

KMO Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KMO-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KMO-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen KMO-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KMO-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von KMO-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des KMO-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KMO-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.