Plásmido CRISPR de Activación (h) KIR4.1: sc-402244-ACT

KCNJ10 codifica el canal de potasio rectificador hacia el interior KIR4.1, un determinante clave del potencial de membrana y del amortiguamiento del potasio en contextos gliales y epiteliales. En el sistema nervioso central, KIR4.1 favorece la eliminación del K+ extracelular y el amortiguamiento espacial vinculados a la excitabilidad neuronal, la homeostasis de los astrocitos y los procesos de acoplamiento ión/agua. La actividad del canal se integra con el mantenimiento de los gradientes electroquímicos e influye en la señalización aguas abajo mediante cambios en el potencial de reposo y en la excitabilidad celular. Las alteraciones genéticas y funcionales de KCNJ10 se han asociado con fenotipos del neurodesarrollo y relacionados con convulsiones, lo que respalda su relevancia en estudios de disfunción de canales iónicos y biología glial.

KIR4.1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de KCNJ10 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

KIR4.1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus KCNJ10 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional KCNJ10, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de KIR4.1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo KCNJ10 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de KIR4.1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía KIR4.1 en células tumorales con expresión de KCNJ10 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.