Plasmide CRISPR d'Activation (h) KIR2.1: sc-401974-ACT

KCNJ2 code la sous-unité du canal potassique à rectification entrante KIR2.1, un déterminant clé du potentiel de membrane au repos et de la repolarisation du potentiel d’action dans les cellules excitables. En conduisant les courants IK1, KIR2.1 stabilise l’excitabilité membranaire et façonne le comportement électrophysiologique du muscle cardiaque et du muscle squelettique, en s’intégrant aux voies d’homéostasie ionique qui couplent le voltage membranaire à la gestion du calcium et à la contractilité. Une dérégulation de l’activité ou de l’expression de KCNJ2 est associée à des phénotypes d’arythmie héréditaire et à des dysfonctions neuromusculaires, ce qui en fait une cible pertinente pour les études mécanistiques des canalopathies et de la signalisation électrique. In vitro, la modulation des niveaux de KIR2.1 est couramment utilisée pour explorer les programmes transcriptionnels dépendants du potentiel de membrane, les seuils d’excitabilité et les interactions au sein des réseaux de canaux ioniques.

KIR2.1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KCNJ2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

KIR2.1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KCNJ2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KCNJ2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de KIR2.1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KCNJ2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de KIR2.1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie KIR2.1 dans les cellules tumorales présentant une expression de KCNJ2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.