Keap1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400190-ACT

Das humane KEAP1-Gen kodiert das Kelch-like ECH-associated Protein 1 (Keap1), einen zytosolischen Adapter für einen CUL3-basierten E3-Ubiquitin-Ligase-Komplex, der den proteasomalen Abbau von NRF2 (NFE2L2) reguliert. Durch das Erkennen elektrophiler und oxidativer Stresssignale über reaktive Cysteinreste moduliert Keap1 die nukleäre Anreicherung von NRF2 sowie die Transkription von Genen der antioxidativen Antwort, Entgiftung und metabolischen Stressantwort. Diese KEAP1–NRF2-Achse verknüpft Redoxhomöostase mit Proteostase und entzündungsassoziierter Signalgebung und beeinflusst die zelluläre Empfindlichkeit gegenüber Xenobiotika und mitochondrialem Stress. Eine Dysregulation der KEAP1-Funktion und eine veränderte NRF2-Aktivität werden häufig in der Krebsbiologie und bei anderen Erkrankungen untersucht, die durch oxidativen Stress und metabolische Umprogrammierung gekennzeichnet sind.

Keap1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KEAP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Keap1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KEAP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KEAP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Keap1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KEAP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Keap1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Keap1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KEAP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.