KCC2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-425338-ACT

Slc12a5 kodiert den neuronenspezifischen K+-Cl−-Cotransporter KCC2, einen entscheidenden Faktor für die intrazelluläre Chlorid-Homöostase, der im reifen zentralen Nervensystem hyperpolarisierende GABAerge und glyzinerge Hemmung ermöglicht. Durch den Export von Cl− unterstützt KCC2 die inhibitorische synaptische Transmission, reguliert die neuronale Erregbarkeit und beeinflusst die aktivitätsabhängige synaptische Reifung sowie die Entwicklung dendritischer Spines. Die KCC2-Funktion greift in phosphorylierungsabhängige Signalwege und Membran-Trafficking-Prozesse ein, die während Entwicklung und Plastizität die Oberflächenstabilität und Transportkapazität des Transporters feinabstimmen. Eine veränderte KCC2-Expression oder -Regulation wird mit einer gestörten Erregungs-Hemmungs-Balance in Verbindung gebracht und wurde in Forschungszusammenhängen u. a. mit Epilepsie, neuropathischen Schmerzen, Phänotypen im Autismusspektrum sowie weiteren neuroentwicklungsbezogenen und neuropsychiatrischen Kontexten assoziiert.

KCC2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Slc12a5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

KCC2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Slc12a5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Slc12a5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen KCC2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Slc12a5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von KCC2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des KCC2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Slc12a5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.