Plasmide CRISPR d'Activation (h) KCC2: sc-402080-ACT

Le gène humain SLC12A5 code le cotransporteur neuronospécifique K+/Cl− KCC2, un régulateur clé de l’homéostasie intracellulaire du chlorure qui façonne la polarité et l’efficacité de la neurotransmission GABAergique et glycinergique. En couplant l’extrusion de K+ et de Cl−, KCC2 soutient la signalisation synaptique inhibitrice, la maturation neuronale et la plasticité dépendante de l’activité, et interagit avec des processus cytosquelettiques et de trafic intracellulaire qui contrôlent sa localisation membranaire. Une expression ou une fonction altérée de KCC2 a été associée à une perturbation de l’équilibre excitation–inhibition et à une hyperexcitabilité des réseaux dans de nombreux contextes de maladies neurodéveloppementales et neurologiques. Par conséquent, SLC12A5 est largement étudié dans les voies qui régissent l’inhibition synaptique, la différenciation neuronale et la stabilité des circuits.

KCC2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC12A5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

KCC2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC12A5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC12A5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de KCC2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC12A5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de KCC2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie KCC2 dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC12A5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.