karyopherin α1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402324-ACT

KPNA1 kodiert Karyopherin alpha 1, einen Importin‑α‑Adapter, der klassische nukleäre Lokalisationssignale erkennt und Frachtproteine an Importin‑β koppelt, um einen durch die Ran‑GTPase regulierten Transport durch den Kernporenkomplex zu ermöglichen. Indem KPNA1 den Kernimport von Transkriptionsfaktoren, Zellzyklusregulatoren und Proteinen der DNA‑Schadensantwort steuert, prägt es Genexpressionsprogramme, die Chromatinregulation und stressadaptive Signalwege. Eine veränderte nukleozytoplasmatische Transportdynamik unter Beteiligung von Importin‑Signalwegen wurde mit onkogenem Signaling, beeinträchtigten Immun‑ und Entzündungsantworten sowie Abhängigkeiten im viralen Lebenszyklus in Verbindung gebracht, wodurch KPNA1 für mechanistische Untersuchungen dieser Prozesse relevant ist. Die Aktivität von KPNA1 ist zudem für Proteostase sowie Phänotypen der nukleären Kompartimentierung bedeutsam, die Differenzierung und zelluläre Identität beeinflussen.

karyopherin α1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KPNA1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

karyopherin α1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KPNA1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KPNA1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen karyopherin α1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KPNA1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von karyopherin α1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des karyopherin α1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KPNA1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.