Plasmide CRISPR d'Activation (h) KANK4: sc-414866-ACT

KANK4 humain (KN motif and ankyrin repeat domains 4) code un adaptateur du cytosquelette qui contribue à la coordination entre les microtubules corticaux et l’actine, ainsi qu’aux interactions cellule–matrice. Grâce à des interactions dépendantes du motif KN avec des membres de la famille des kinésines et à la liaison à des protéines médiée par les répétitions ankyrine, KANK4 est associé à la dynamique des adhérences focales, à la polarité cellulaire et à la migration directionnelle, des processus qui façonnent l’architecture tissulaire et la mécanotransduction. Les protéines de la famille KANK ont été étudiées dans des voies impliquant la signalisation des GTPases Rho, le renouvellement des adhérences et le remodelage du cytosquelette, ce qui rend KANK4 pertinente pour l’étude des comportements invasifs et des phénotypes de motilité cellulaire altérée. Une expression dérégulée ou des altérations génomiques de régulateurs du cytosquelette/de l’adhérence, dont KANK4, sont fréquemment examinées en biologie du cancer et dans des contextes développementaux où les programmes de migration et d’adhérence sont perturbés.

KANK4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KANK4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

KANK4 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KANK4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KANK4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de KANK4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KANK4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de KANK4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie KANK4 dans les cellules tumorales présentant une expression de KANK4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.