Plasmide CRISPR d'Activation (h) KA2: sc-405272-ACT

GRIK5 code pour la sous-unité KA2 du récepteur au kainate, un partenaire obligatoire qui s’assemble avec d’autres sous-unités de récepteurs au kainate pour former des récepteurs ionotropes du glutamate fonctionnels au niveau des synapses excitatrices. Les récepteurs contenant KA2 contribuent à la transmission synaptique rapide et à la plasticité dépendante de l’activité en régulant les flux de cations et en modulant l’excitabilité neuronale, reliant ainsi GRIK5 aux réseaux de signalisation glutamatergiques et aux voies en aval dépendantes du calcium. Par leurs effets sur l’intégration synaptique et l’équilibre excitation/inhibition à l’échelle des circuits, des altérations de l’expression de KA2 ou de la composition des récepteurs ont été étudiées dans le contexte de phénotypes neurodéveloppementaux et neuropsychiatriques, ainsi que de la susceptibilité aux crises. Ces propriétés font de GRIK5 un nœud utile pour étudier l’assemblage et le trafic des récepteurs synaptiques, ainsi que la neurotransmission excitatrice dans des modèles cellulaires humains.

KA2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GRIK5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

KA2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GRIK5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GRIK5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de KA2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GRIK5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de KA2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie KA2 dans les cellules tumorales présentant une expression de GRIK5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.