Plasmide CRISPR d'Activation (h) ITM2B: sc-403561-ACT

ITM2B (protéine membranaire intégrale 2B, également connue sous le nom de BRI2) code une protéine transmembranaire de type II qui transite par la voie sécrétoire et subit un traitement protéolytique régulé afin de générer des fragments luminales. ITM2B participe à l’homéostasie des protéines membranaires et au trafic vésiculaire, et a été associée à la modulation du traitement amyloïdogène ainsi qu’aux voies de protéostasie neuronale. Dans le système nerveux, une altération de la fonction d’ITM2B est liée à des phénotypes neurodégénératifs et à la biologie de l’agrégation protéique, notamment à des démences familiales causées par des mutations d’ITM2B. Ces caractéristiques font d’ITM2B un nœud pertinent pour étudier la dynamique de l’endomembrane, la signalisation dépendante de la protéolyse et les mécanismes de perturbation de la protéostasie impliqués dans la neurodégénérescence.

ITM2B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ITM2B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ITM2B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ITM2B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ITM2B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ITM2B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ITM2B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ITM2B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ITM2B dans les cellules tumorales présentant une expression de ITM2B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.