Plasmide CRISPR d'Activation (h) IRG1: sc-418001-ACT

L’ACOD1 humain code IRG1, une enzyme mitochondriale inductible qui convertit le cis-aconitate en itaconate, reliant le métabolisme du cycle de l’acide tricarboxylique (cycle de Krebs) à la fonction effectrice de l’immunité innée. L’itaconate module l’état rédox cellulaire et la signalisation inflammatoire en influençant les réponses antioxydantes dépendantes de NRF2 et en atténuant des sorties pro-inflammatoires telles que la transcription dirigée par NF-κB, remodelant ainsi l’activation des macrophages et les programmes antimicrobiens. IRG1 est fortement induite en aval des voies TLR et de l’interféron de type I lors d’infections et d’inflammations stériles, et ce reprogrammation métabolique recoupe des voies contrôlant les ROS, la signalisation du succinate et la production de cytokines. Une activité dérégulée d’ACOD1/IRG1 a été étudiée dans le contexte de maladies inflammatoires et de la biologie myéloïde associée aux tumeurs, où l’état immunométabolique peut influencer les lésions tissulaires et l’immunosuppression.

IRG1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ACOD1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

IRG1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ACOD1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ACOD1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de IRG1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ACOD1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de IRG1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie IRG1 dans les cellules tumorales présentant une expression de ACOD1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.